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细胞治疗产品的生物分析概览

发布时间:

2026-04-03

细胞与基因治疗（Cell and Gene Therapy, CGT）按产品形式可主要分为体外（Ex vivo）基因治疗和体内（In vivo）基因治疗

细胞与基因治疗产品概述

细胞与基因治疗（Cell and Gene Therapy, CGT）按产品形式可主要分为体外（Ex vivo）基因治疗和体内（In vivo）基因治疗。一般来说，体外基因治疗主要涉及基因改造的细胞疗法（Cell therapy），指获取患者的目的细胞后，在体外经过基因修饰技术（如调节、替换、添加或删除基因等）以改造其生物学特性，再回输至患者体内用于治疗人类疾病的活细胞治疗方式；体内基因治疗则主要指传统的或狭义的基因疗法（Gene therapy），是将治疗产品直接注射至患者体内，在基因水平上干预基因表达、修正的治疗方式。体外（细胞）基因治疗产品在临床应用中主要涉及免疫细胞基因治疗产品、干细胞基因治疗产品和其它细胞基因治疗产品；而体内基因治疗主要包括病毒载体基因治疗、脂质载体基因治疗和核酸基因治疗。不过，体内基因治疗产品将不在本推文的论述范畴，可以参考康维讯Kanwhish公众号中的其它相关推文。

免疫细胞基因治疗是通过采集患者自体或同种异体的免疫细胞，经过体外培养并进行基因修饰和改造，使其具有靶向杀伤能力，再回输至患者体内，通过直接靶向杀伤目标细胞、调节免疫系统、减弱免疫耐受、激活免疫响应等方式进行干预和治疗。根据采用不同免疫细胞、基因工程改造特点，免疫细胞基因治疗的主要分类为CAR-T、CAR-NK、T细胞受体基因工程改造的T细胞（T cell receptor - engineered T-cell, TCR-T）等方式。不过，对于未经基因改造的细胞疗法诸如肿瘤浸润淋巴细胞（Tumor - infiltrating lymphocytes, TILs）、细胞因子诱导的杀伤细胞（Cytokine - induced killer cells, CIK）等不属于免疫细胞基因治疗。发展最为成熟的免疫细胞基因治疗是针对淋巴瘤的anti-CD19和anti-BCMA CAR-T细胞疗法，目前已有多款CAR-T产品获得中国NMPA、美国FDA、或欧盟EMA等监管局批准上市，还有一款是同种异体T淋巴细胞自杀基因免疫疗法的Zalmoxis®（已退市），用于辅助治疗造血干细胞移植后的移植物抗宿主病。

干细胞具有自我更新、多向分化潜能、良好组织相容性的特性，可作为基因治疗药物的细胞载体，在再生医学领域和CGT领域具有广阔的应用前景。人源干细胞及其衍生细胞的基因治疗产品涉及人源自体或同种异体干细胞，经体外操作（包括提取、分离、纯化、培养、扩增、基因编辑/基因修饰、诱导分化、冻存及复苏、运输等一系列过程）形成临床试验的产品制剂，对干细胞的错误基因进行编辑和修正后再回输（植入）至患者体内，可用于遗传性疾病的干预和治疗。干细胞基因治疗产品不仅具有细胞治疗产品的特点还兼具基因治疗产品的特性，对临床试验设计要求更高，但现阶段临床数据多是单中心、小样本、罕见疾病，对该类治疗产品的开发以及其相关的安全性、有效性带来诸多挑战。因此，科学、充分的生物分析能够保障干细胞基因治疗产品在临床试验阶段顺利进行，是不可或缺的重要组成部分。干细胞基因治疗主要集中在罕见病和神经退行性疾病，在欧美地区获批上市的干细胞基因治疗产品包括用于治疗腺苷脱氨酶严重联合免疫缺陷症的Strimvelis®、治疗输血依赖性β-地中海贫血的Zynteglo®、治疗早期脑型肾上腺脑白质营养不良的Skysona®以及治疗早发性异染性脑白质营养不良的Libmeldy®。

细胞治疗产品的生物分析

在CGT产品进入体内后，细胞可能分化成预期和非预期的多种细胞类型、互相之间进行转换，尤其是由多种细胞亚群混合的治疗产品，也可能发展至其它作用机制（MOA）的治疗功能。另一方面，细胞产品由循环系统递送全身可能导致细胞分布到各个组织，即使移植至目标组织区域（如骨髓）也可能产生非预期的迁移，因此需要对细胞产品的生物分布、归巢和追踪监测进行研究。当CGT产品整合至基因组时可能发生不受控的基因编辑（基因突变），导致关键基因的激活或失活，进而诱发癌变的发生。CGT产品既有细胞治疗产品的特点，也有基因治疗产品的潜在风险，临床试验的生物分析则是CGT产品研发的重要内容之一，因为充分的临床生物分析能够：

阐明CGT产品在人体内的药代（细胞）动力学特征，为给药途径、给药剂量等选择提供支持性证据；

确认CGT产品的MOA，基因修饰的目的、功能，以及转基因蛋白的表达水平，明确CGT产品的治疗效果和治疗机理；

根据潜在的生物风险因素，预测人体给药后的一系列免疫反应特征，确认不良免疫反应（适应性免疫和固有免疫）的临床监测指标，为制定临床风险控制措施提供参考依据。

因此，建议开展充分的生物分析研究，收集用于评估的数据和信息，以确立所开发的CGT产品在生物分析角度具有合理的、可接受的获益风险比，为临床试验设计和风险控制策略提供证据支持。

药代（细胞）动力学分析

CGT产品的药代动力学（细胞动力学）特征与传统小分子药物或大分子生物药有明显的区别，大多数CGT产品难以通过传统的吸收、分布、代谢和排泄（ADME）等分类方式进行药代动力学评估。CGT产品的药代动力学研究应能阐明细胞产品在体内的生物学过程以及伴随的生物学行为，根据细胞治疗产品类型和特点（尤其是免疫细胞基因治疗与干细胞基因治疗）、研究目的及检测指标的临床价值，建立合理的生物分析方法并对方法进行必要的验证。药代动力学研究应主要关注目标细胞进入体内后的数量变化、监测细胞活力/表型分化（例如细胞表型和功能标志物）、持续时间（例如血药浓度-时间曲线下面积、达峰浓度、达峰时间等特征常数）、预期存活期内的功能（或替代标志物）、体内生物分布、异位灶、组织嗜性/迁移、生物分子的表达和/或分泌、以及与宿主组织的相互作用关系等特征；有时，相互作用还可以包括细胞治疗产品的非细胞成分以及分泌的生物活性分子引起的相关组织反应。

CGT产品的药代动力学检测通常建议在方法开发阶段采用多种检测方式评估并监测目标细胞在体内的情况，由于免疫细胞基因治疗和干细胞基因治疗是经过基因工程技术修饰过的产品，可以同时采用荧光定量PCR（qPCR）和流式细胞术（Flow cytometry）进行分析，这两种技术手段分别测定外源基因拷贝数和目标表型阳性（如CAR+、外源基因+）的细胞数量变化，可以更全面的分析细胞治疗产品在体内的扩增和存活情况。在设计药代动力学检测方法和相互验证时，可以将PCR法检测结果理解为产品在机体内的“总数”，而流式细胞术的检测结果则更偏向于“有效数”（图2）。广泛应用的PCR法包括qPCR和数字PCR（dPCR），用于监测体内转基因的拷贝数。首先根据转导的外源基因序列设计高度特异性的引物和探针（通常设计的区域可位于scFv、两段基因的交界处等）、制备基因组DNA标准品、选择适宜的内参基因（如ACTIN、CDKN1A），以及根据qPCR的反应效率和gDNA量进行因子修正，最终在受试者血液样品中确定单位gDNA的CAR转基因拷贝数。为了评估qPCR法在CAR-T细胞中的分析灵敏度和重复性，可应用数字PCR技术对CAR拷贝数进行绝对定量，并将结果作为qPCR检测方法的参考拷贝数。数字PCR技术还能增加罕见事件的检测机率并减少检测的变异性，当采样的时间足够长会导致目标分析物的丰度变得很低，进而需要灵敏度极高的分析方法时，可考虑开发基于数字PCR的分析方法。对于基于流式细胞术的方法开发和验证阶段首要考虑的是构建适用的标准阳性细胞样品，理想阳性对照品则是细胞治疗产品本身，但实际情况大多难以实现，因此构建阳性细胞标准品的目标则是最大程度接近预期用途样品。此外，关键试剂的选择和制备、方法灵敏度优化也是前期在产品开发阶段值得关注的重点。例如CAR-T细胞产品可通过对CAR+细胞的测定来表征产品的药代动力学特征，尽管在分析灵敏度上有时稍逊色于PCR法，但其反映形式是细胞水平的，更加契合“细胞动力学”的生物学含义，也能同步分析各细胞亚群的动态变化。另外，基于流式细胞术的方法开发无需申办方提供核心的CAR序列信息，这是一条显著的优势。