CGT产品的生物分析策略：qPCR/ddPCR方法学开发与验证精选
发布时间:
2026-04-03
随着细胞基因治疗（CGT）的蓬勃发展，目前全球已有几十款CGT产品陆续获批上市
随着细胞基因治疗（CGT）的蓬勃发展，目前全球已有几十款CGT产品陆续获批上市，与之相匹配的，qPCR/ddPCR技术在受监管的生物分析中应用也越来越频繁，更多的CRO公司正在不断承接来自申办方临床试验的生物分析工作，同步需要进行方法学开发和验证。定量PCR和数字PCR（qPCR/ddPCR）法是一种可重复性、灵敏度高、可标准化的核酸序列（基因）定量检测技术，广泛用于CGT产品的生物分析中，例如AAV基因治疗对病毒暴露、分布与脱落的检测，CAR-T细胞基因治疗产品的药代（细胞）动力学分析等。在早期临床前研究和IND研究中，通过建立目的基因的拷贝数定量的方法来进行分析，目前对于qPCR的监管与指南尚不完善，而新一代ddPCR技术则几乎缺乏明确的国家指南。2022年GCC（Global CRO Council）发布的白皮书提供相关共识与推荐，以支持PCR检测技术在不同验证项参数的共识、统一验证方法、以及标准操作程序（SOP）。
在qPCR法的方法学开发和验证中已存在的共识验证项包括：
■ 分析灵敏度（Sensitivity）；
■ 特异性（Specificity）；
■ 选择性（Selectivity）；
■ 准确度（Accuracy）；
■ 批内/批间精密度（Intra-/inter-assay precision）；
■ 定量下限（Lower limits of quantitation, LLOQ）；
■ 定量范围（Range of quantitation）。
此外，部分验证项也可以设计在验证中进行，这包括：
■ 稀释线性（Dilutional linearity）；
■ 样本稳定性（Sample stability）；
■ 重现性（Reproducibility）；
■ 稳健性（Robustness）。
较少作为验证项的有：
■ 平行性（Parallelism）；
■ 抑制性（Inhibition）；
■ 已测样品再分析（Incurred sample reproducibility, ISR）。
大部分研究者在开发qPCR/ddPCR方法时是依据目前已发布的白皮书和监管指南，尽管接受标准可能略有不同，例如标准品和质控样品（QCs）的准确度在±30%、PCR效率在90% ~ 110%。部分研究提供了更加详细的qPCR验证标准，对于精密度和准确度，在每个水平的质控样品中应有≥50%的样品，且在全部的质控样品中≥67%的质控样品应满足%CV ≤ 25%（在上下限时≤45% ）、%RE为±25%（在上下限时±45% ）。质控样品稳定性的接受标准则规定为每份样品重复分析的%CV ≤ 30%，且等份重复（复孔）检测需> 67%。质控样品的%CV也应满足≤ 30%等等。当前最紧迫的问题是方法开发者所采用验证接受标准不统一，这在受监管的生物分析报告中可能带来监管风险。
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