CAR-T Cell篇——基于流式细胞技术的PK方法开发与验证

关于CAR-T细胞

嵌合抗原受体T细胞（Chimeric Antigen Receptor-T Cells，CAR-T cells）是经过基因工程技术将自体或同种异体T淋巴细胞改造成靶向目标细胞的新型杀伤细胞，该疗法已经在血液肿瘤的治疗上取得了瞩目的成效。作为一种治疗方式，CAR-T细胞治疗有别于传统的小分子药物或其它生物制剂，表现出独特的药代动力学（Pharmacokinetics，PK）或细胞动力学（Cellular kinetics）特征。通常受试者静脉注射给药后，最初定位到肺部，随后数小时内将重新分布到脾脏和骨髓。CAR-T细胞能够广泛分布到其它组织，也包括肿瘤部位。值得注意的是，CAR-T药代动力学参数通常仅限于表征循环的CAR-T细胞。它们在短期内循环水平短暂下降，反映了CAR-T细胞具有一定的组织分布容积。随后，通过与肿瘤细胞或正常细胞上的CAR靶点结合，CAR-T细胞被激活并进行增殖，循环CAR-T细胞数量通常在给药后2周内达到峰值。之后CAR-T细胞群逐渐耗损，数量呈现一定程度的下降趋势，不过，部分个体也会观察到CAR-T细胞群的长期存在，这有可能介导持久的抗肿瘤疗效或毒性（Fig. 1）。CAR-T细胞剂量和暴露之间的关系是高度可变的，这可能受到CAR-T产品设计、患者的免疫功能、CAR-T细胞的表型、肿瘤负荷（疾病阶段）、淋巴细胞清除性化疗（Lymphodepleting chemotherapy）和后续免疫调节疗法等的影响。CAR-T细胞PK最常用的测定方法是流式细胞术（Flow cytometry）和定量PCR（qPCR和ddPCR）。

流式细胞技术

流式细胞术在临床试验中广泛用于定量血液中淋巴细胞亚群。使用荧光试剂标记细胞悬液，随后测定并分析细胞的特性。在CAR-T产品的整个治疗周期中，前期的CAR-T制备与后期的给药监测等各阶段均可使用流式细胞术来表征细胞状态，包括白细胞去除产物的评估、制成品表征、输注后监测和临床疗效。在CAR-T制备过程中，使用流式细胞术和其他技术的组合形式可建立细胞治疗产品的转导效率、存活率、效力、纯度和表型等关键质量属性（Critical quality attributes，CQA）。CAR-T产品的功能表征将评估细胞增殖、脱颗粒和细胞因子释放能力。纯度测定包括肿瘤细胞残留评估以及CAR-T产品中存在的其它类型免疫细胞（例如，单核细胞、NK细胞、B细胞）。在最终的产品中CD4+和CD8+ T细胞的比例也是流式细胞术可确定的一个CQA（Table 1）。

通过CAR-T产品给药后监测外周血或骨髓样本中CAR-T细胞随时间推移的数量和表型来评估药代动力学（或细胞动力学）。值得注意的是，通过流式细胞术定量的峰值CAR-T细胞数量（Cmax）发现与白血病患者的临床响应相关。由于输注的CAR-T细胞能够活化、增殖、成熟和长期持续存在，因此它们的表型表征包括分化、活化、耗竭和衰老的生物标志物。进一步，患者随访评估可包括白血病患者的微小残留病（Minimal residual disease，MRD），并提供与疗效相关的重要临床试验信息。流式细胞术可用于CAR-T治疗的所有阶段，不过，CAR-T制备、产品表征和输注后患者随访评估之间的一些差别可能会影响方法开发和方法学验证，这包括：检测方法的应用环境（Context of Use，COU）、预期用途样本（Intended use specimen）（例如，即将应用于临床的CAR-T产品）、监管要求、总体质量保证（Quality assurance，QA）和质量控制（Quality controls，QC）等。对于CAR-T产品的PK检测，一般流程如下：（a）Site正式开展临床试验后，受试者接受CAR-T治疗并获取其全血或骨髓样本，样本被寄往检测机构（如中心实验室），中心实验室即刻开展CAR-T PK的样本检测，或者将样本冷冻保存等待检测；（b）检测机构需在首例受试者入组前完成相应的方法开发、检测优化和方法学验证工作，出具方法学验证报告；（c）应用已验证的流式方法检测临床试验样本；（d）获取CAR-T细胞流式检测数据并进行分析，为临床试验提供CAR-T产品的PK数据支持（Fig. 2）。

方法开发（Method Development）

根据我国NMPA以及US FDA法规的要求，以研究目的和检测指标的临床价值来建立合适的生物分析方法并对方法进行必要的验证。临床试验中应对研究要求、可能采取的方法及可行性进行讨论，并注意在细胞治疗产品预期的活性过程中，重点检测细胞的活力、增殖与分化能力、体内的分布/迁移和相关的生物学功能。如果需对细胞治疗产品进行多次（重复）给药，临床方案设计时应考虑细胞治疗产品在体内的预期存活时间及相应的功能。US FDA推荐CAR-T细胞相关的PK参数检测包括：达峰浓度（Cmax）；达峰时间（Tmax）；部分药时曲线下面积（pAUC）；最后观测浓度（Clast）；Clast时间；以及半衰期（t1/2）。同时PK采样需设计足够的时间节点，这通常是在CAR-T治疗后的前两周左右。为了探索CAR-T细胞暴露和响应间的关系，US FDA建议申办方可在有条件的情况下进行功能分析（免疫分型）和CAR-T细胞克隆分析。CAR-T PK设计的第一步应该是为检测建立适用的COU，并确定该检测方法所报告的数据和结果将支持哪些后续的决策。在CAR-T细胞PK方法开发时可能需要留意以下几点：

方法开发样品（Method Development Specimens）■ 基于流式细胞的方法开发，第一个巨大挑战是获得足量的CAR-T阳性样品。目前，已有三种来源的阳性对照细胞被广泛用于CAR-T细胞PK检测方法的开发，包括：（a）稳定转染的细胞系、（b）转导携带CAR-T病毒载体的正常供体T细胞、以及（c）最终的药物产品（患者来源的CAR-T细胞）。这些CAR-T阳性对照品都有其优势和局限性的地方。■ 尽管构建表达水平已知的均质CAR-T转导细胞系是早期试剂筛选的绝佳选择，但它们不包含患者样品中能够创建流式细胞设门方法所需的T细胞相关标志物和其他循环细胞标志物。在构建更加接近预期用途样本时可将CAR-T转导至正常供体的T淋巴细胞中使其表达，然后将其与全血或骨髓样本混合并用于方法开发。该对照品需要慢病毒或逆转录病毒载体进行转导，相比细胞系构建较为复杂，也不包含异常细胞群的检出。理想的CAR-T阳性样品应当是药物产品本身（患者自体细胞所构建的CAR-T产品），但受限于产品细胞的数量和可用性太低，一般仅在关键验证或临床样本检测时才会考虑。获得试验所需足量的CAR-T 阳性对照品并非易事，在方法开发过程中至少保证能够获得三份独立批次的稳定CAR-T对照品。

CAR-T检测试剂（CAR-T Detection Reagents）■ CAR-T细胞检测首要考虑的关键试剂是CAR-T检测试剂。有多种CAR-T检测试剂可供选择，例如抗CAR-T独特型单克隆抗体（Anti-CAR-T idiotype monoclonal antibodies）、靶点融合蛋白（Target fusion protein）、Protein L和抗内置标记单克隆抗体（Anti-tag mAb）。选择CAR-T检测试剂时，必须评估试剂对检测特异性的影响。大多数抗独特型抗体对CAR-T具有高亲和力和高特异性。因此，优先推荐抗独特型抗体用于产品表征以及PK测定。这类试剂通常需要6-12个月的开发时间。定制试剂需要充分验证其特异性、交叉反应性、稳定性、纯度和荧光素与蛋白质结合比率（Fluorescence-to-protein ratio，F/P ratio），并出具分析证明书（Certificate of analysis，COA）。

方法验证（Method Validation）

方法学验证分析方法的验证受到COU、监管机构、监管要求和患者风险的影响。研究者需确认验证细节，包括验证项、检测频次和可接受标准，并确定检测中产生哪些可报告的结果将进行验证；这些报告的结果必须针对每个选定的验证项进行确证。需要注意的是，每份验证报告的灵敏度、精密度、稳定性等验证项都有可能不同。 大多数验证项可在CAR-T混合健康供体/患者样品上进行，根据COU，可能需要使用预期用途样品进行验证实验。与临床试验相似，假如临床样本检测前尚未获得预期用途样品，则允许在没有预期用途样品产生数据和结果的情况下先发布临时验证报告，检测机构在接收到首份临床样本后用于最终验证的评估，并纳入最终的验证报告。如采用此方法，研究者必须遵循法规要求的流程，并充分了解最终验证报告生效之前所测试的样品数据应如何发布在临时验证报告中，同时在实施前也可能需要与监管机构进行沟通。

灵敏度（Sensitivity）
■ 流式方法的分析灵敏度是指精确定量低信号值的细胞群频率、绝对计数或抗原表达，包括将信号值与背景值的区分能力（LOD）、在没有测量物的情况下预期最高信号值（LOB和LLOQ）。LOB和LOD的建立指在空白样品（多数为正常供体样品）中进行的计算和评估；创建不同浓度水平的CAR-T样品来进行LLOQ的验证，包括评估三个样品/供体，其中每份样品至少掺入五个CAR-T水平，并获得平均值、SD、CV以及细胞群频率等。在建立LLOQ时（a）所有检测值> LOB、（b）检测平均值与稀释浓度成比例、（c）满足精密度的可接受标准（%CV）。值得注意的是，在淋巴细胞清除性化疗后，患者样本中的淋巴细胞可能与验证中使用的正常供体样品具有显着不同的检测特性。建议LLOQ验证至少包含三名循环淋巴细胞水平较低的患者样本，以确保方法学验证的可靠性。
特异性（Specificity）
■ 特异性是指检测方法能够特异性地测定目标细胞群和/或目标抗原。前期的方法开发和优化已经获得相应的数据，在方法学验证中可一并体现。
选择性（Selectivity）
■ 选择性是指干扰物质（如可溶性物质和治疗性药品）对测定方法的影响。如果患者群体已接受其它治疗方式，则应评估选择性。将干扰物以预期生理水平的三个浓度掺入到三个验证样品中，这些样品将与纯品并行检测，以验证细胞群分布对干扰物的耐受程度。选择性还指检测方法对不同疾病的样品进行等效检测的能力。如CAR-T产品在临床研究中应用于多种适应症，则应评估每种适应症三个样品的选择性。如果样品稀少难以获得、或适应症种类过多，则应在验证计划中提供理由。
精密度（Precision）
■ 精密度评估包括重现性（Reproducibility, or inter-assay precision）、重复性（Repeatability, or intra-assay precision）、操作员间和仪器间，并且应涵盖分析范围的四到六个样品。在灵敏度和准确度检测的样本也可以重新用于精密度的评估。流式精密度一般的可接受标准是≤ 25%CV（LLOQ为30%-35%），或COU另有说明。
稳定性（Stability）
■ 大多数用于测定PK的临床试验样本（新鲜全血或骨髓）将被收集并集中运送到检测机构（如中心实验室），可能在收集后的24-72小时内无法进行流式检测，因此CAR-T PK检测需要进行样品稳定性评估。CAR-T细胞的PK稳定性挑战在于难以收集取样后2小时内的基线样品，因此可用24小时的样品代替为基线样品（这一点需在验证报告文件中说明）。稳定性评估至少含有一个时间节点，即临床试验样本预计运送至检测机构的最长时间点。需要特别注意的是，对于大多数验证项是可以接受掺入CAR-T标品的，但稳定性验证项并非如此，我们很难将掺入的CAR-T细胞标品与患者真实的血液内循环CAR-T细胞稳定性进行关联。建议采用临床试验初始阶段的剩余样本进行稳定性研究。
准确度（Accuracy）
■ CAR-T产品的放行程序可能已包括了定量CAR-T的检测方法（例如qPCR）。可以通过与该类检测方法进行比较来验证准确度。建议在每个平台上对至少三个样品（低、中、高）进行测试，一式三份。由于每种方法的读值是不同的，因此可以使用线性回归分析和非参数分析方法（如，Spearman Rho）进行分析，以确定方法之间的一致程度。

小结

至此，CAR-T细胞PK检测的方法开发与方法学验证就简述到这里啦！由于临床CAR-T治疗的实际应用依旧存在诸多待解决的问题，分享下期更精彩~助力临床前/临床的生物分析，由最专业的团队一站式设计CAR-T生物分析检测方案、方法开发、方法学验证以及CAR-T细胞的临床样本检测和分析服务。

参考文献（References）

Nathaniel Dasyam, Philip George, Robert Weinkove. Chimeric antigen receptor T-cell therapies: Optimising the dose[J]. Br J Clin Pharmacol. 2020; 86(9):1678-1689.Ghanashyam Sarikonda, Mélissa Mathieu,
Mahwish Natalia, et al. Best practices for the development, analytical
validation and clinical implementation of flow cytometric methods for chimeric
antigen receptor T cell analyses[J]. Cytometry B Clin Cytom. 2021; 100(1):79-91.

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